浅谈HPLC法测定有关物质时已知杂质的盘算要领
凭据药品注册的国际技术要求(ICH)中杂质的寄义, 杂质分为有机杂质、无机杂质和残留溶剂。有关物质是杂质的一种, 主要是指有机杂质。它的检查要领许多, 而其中的HPLC法具有专属性强、疏散效果好、灵敏度高、剖析速度快、重复性好、操作简便等诸多优点, 且能与多种类型检测器联合应用, 能满足大大都化合物种类的检测需要, 比较切合有关物质检查时杂质含量低、种类多的特点 。
HPLC法测定有关物质中已知杂质的测定要领许多, 盘算要领也相应许多,每种盘算要领都有差别的意义及其优缺点, 下面参考海内外药品标准和相关期刊文献, 结合在药品检验中的实际事情, 对这些盘算要领作一简单探讨, 以期为药品质量标准的建立或进行相关研究时对有关物质检查中已知杂质的盘算要领的选择提供借鉴和参考。
表1是种种盘算要领的盘算公式及其主要优缺点。
1 面积归一化法
优缺点：
具有与称样量及进样量基本不相关的特点, 因此重复性和重现性均良好, 不需要折算, 降低了实验中对称样量精密度的要求, 降低了检验本钱, 操作越发简便、快捷, 省去了盘算历程。但当杂质是微量的时候需增加要领的灵敏度, 就要增加进样量, 此时主身分可能凌驾仪器检测规模, 或虽然在仪器检测规模内, 理论上讲此时可能与主身分不在同一线性规模内。正是由于各杂质的响应因子差别、含量较低和需要较宽的线性规模等因素的影响,《中国药典》2005年版二部附录中特别强调“本法通常只能用于大概考察供试品中的杂质含量。除另有划定外, 一般不宜用于微量杂质的检查” 这也在一定水平上限制了本法的使用。
2.1 不加校正因子的主身分自身比照法
此要领是现行版《中国药典》和其他国家药品标准及药品研发时制定的质量标准中应用最多、最广泛的有关物质的测定要领和盘算要领。
要领介绍：
本法是配制一个浓度与杂质限度相当的供试品溶液作为比照溶液, 一般是由供试品溶液直接稀释获得。本法不需要杂质比照品, 当无法获得杂质比照品时, 可接纳不加校正因子的主身分自身比照法来盘算杂质的含量。同面积归一化一样, 本法也是在假定供试品溶液中所有身分均出峰、所有杂质均与主身分疏散且各杂质和主身分的响应因子均相同的前提下进行的。
优缺点：
同面积归一化一样, 本法的优点是操作简单、运算便当, 无需杂质比照品;缺点是忽略了各杂质与主身分的响应因子可能差别的事实, 导致了实验测得的杂质含量可能与真正的杂质含量纷歧致。
别的, 不加校正因子的主身分自身比照法会保存稀释办法、进样针和进样阀残留、进样误差等影响因素, 往往也会导致盘算出的杂质与真实含量之间保存一定的误差；但不加校正因子的主身分自身比照法可以解决面积归一化法中可能泛起的仪器检测规模和线性规模问题。
2.2 加校正因子的主身分自身比照法
目前在海内应用较少, 但在外洋药品标准中应用比较广泛。
要领介绍：
该要领的操作办法基本与2.1 相同, 唯一差别的是在盘算时把杂质相当于主身分的响应因子考虑进去。本法相当于一个简化的内标法, 同时也是对杂质比照品外标法的简化, 即在研究要领学时, 利用杂质比照品和主身分比照品, 划分测定杂质和主身分的线性方程, 以斜率之比盘算杂质相关于主身分的校正因子, 此校正因子可直接载入质量标准中, 在通例检验时用以校正该杂质的实测峰面积。在实际测准时, 可接纳相对保存时间进行杂质定位。
优缺点：
此法的优点是在日常检验中省去了杂质比照品(特别是在杂质不敷稳定或将来供应有困难时显得尤其重要), 同时又考虑到了杂质与主身分的响应因子可能差别所引起的测定误差;缺点是相对保存时间在差别实验室间可能有所波动, 特别是当供试品中保存多个杂质而又疏散欠好时可能造成杂质定位困难。需要指出的是，如果已知杂质对主身分的相对响应因子凌驾0.9 ～ 1.1规模时, 宜用加校正因子的主身分自身比照法或杂质比照品外标法法进行盘算。
3 主身分比照品外标法
《美国药典》多接纳加校正因子或不加校正因子的主身分比照品外标法来对已知杂质进行盘算。
要领介绍：
主身分比照品外标法包括加不校正因子的主身分比照品外标法和加校正因子的主身分比照品外标法。操作、盘算划分与不加校正因子和加校正因子的主身分自身比照法基本一样，唯一差别的是前者要用主身分比照品制备一个浓度与杂质限度相当的溶液作为比照品溶液, 后者是由供试品溶液直接稀释获得一个浓度与杂质限度相当的溶液作为比照溶液。
优缺点：
由于主身分比照品是经过标定的, 其纯度或量值会比较准确, 而制剂中主身分的实际含量与标示量有时会不完全一致, 因此接纳比照品外标法盘算出的杂质的实际绝对含量要比自身比照法准确一些。虽然, 由于本法要使用主身分比照品，从而导致操作本钱会提高一些, 操作历程会繁琐一些。
4 杂质比照品外标法
要领介绍：
杂质比照品外标法要求提供一定纯度的杂质比照品, 剖析时需制备一个浓度应与杂质限度相当的溶液作为杂质比照品溶液。由于杂质比照品外标法可以解决上述几种测定要领和盘算要领保存的种种问题, 特别是杂质与主身分响应纷歧致的问题, 因此, 本法能反应药品中该杂质的真实含量。
优缺点：
如果杂质比照品容易获得并能连续供应, 建议在有关物质检查中已知杂质的测定和盘算时首选该法, 特别是当该杂质与主身分的相对响应因子相差较大(凌驾0.9 ～ 1.1规模)或该杂质有毒副作用时, 欧美药典中接纳此法进行有关物质盘算的品种也不在少数。
虽然杂质比照品的获得和供应比较困难, 在国家药品标准中是否引入杂质比照品应权衡并慎重, 但由于该法能真实反应药品稚癯一杂质的含量, 因此接纳杂质比照品外标法应该是今后有关物质检查时努力的偏向。
5 加转换因子的杂质比照品外标法
要领介绍：
加转换因子的杂质比照品外标法其实也是杂质比照品外标法的一种。本法的操作要领与测定要领同杂质比照品外标法一样, 差别的是在盘算公式中多乘以一个转换因子, 其意义就是把样品稚癯一杂质的含量转换成相当于主身分自己的重量百分比水平。
假设某一制剂的标示量为100 mg, 接纳杂质比照品外标法盘算出某一杂质的含量为主身分的1.0%, 若该杂质与主身分的分子量之比为1∶2, 则按加转换因子的杂质比照品外标法盘算出的该杂质的含量为2.0%, 即该杂质的真实含量为1.0mg, 但通太过子量之比换算成相当于主身分的含量为2.0mg。
优缺点：
结果较准确。但由于杂质的分子量可能大于或小于主身分的分子量(即主身分的分子量/杂质的分子量可能小于1或大于1), 因此接纳本法盘算出的某一杂质的含量结果也可能比面积归一化法、主身分自身比照法、主身分比照品外标法和杂质比照品外标法盘算出的结果偏低或偏高。
6 加转换因子和校正因子的主身分比照品外标法
要领介绍：
加转换因子和校正因子的主身分比照品外标法其实也是主身分比照品外标法的一种, 就是在加校正因子的主身分比照品外标法的基础上乘以转换因子。
优缺点：
其操作和优缺点与加校正因子的主身分比照品外标法一样, 其意义与加转换因子的杂质比照品外标法一样, 也是通过杂质和主身分分子量之比的换算把该杂质的含量转换成相当于主身分自己的百分比水平。
7 内标法
要领介绍：
按各品种项下的划定, 划分精密量取含有一定浓度内标物质的比照品溶液和供试品溶液, 注入液相色谱仪, 纪录色谱图, 测定比照品溶液中比照品和内标物质的峰面积及供试品溶液中待测身分(这里指待测杂质)和内标物质的峰面积, 凭据表1 中的公式盘算杂质的含量。
优缺点：
内标法主要是为了解决仪器进样精密度和药物中所含身分的接纳率的问题, 这种要领可以抵消仪器和历程带来的误差。但在以常压六通阀定量环进样和接纳率已经验证的情况下, 意义已不大, 加之内标物质的选择比较困难, 内标物质的添加会导致疏散难度的增大, 操作历程越发啰嗦等问题, 本法已经使用很少。
现举例说明差别盘算要领对HPLC法测定有关物质中已知杂质测定结果的影响�？垢哐挂┞砝此嵋滥瞧绽杏泄匚镏实呐趟阋�。
《中国药典》2005年版二部中所有杂质(包括已知杂质依那普利拉和依那普利双酮)接纳的均是不加校正因子的主身分自身比照法 ;
《英国药典》2008年版中已知杂质依那普利拉和依那普利双酮接纳的是杂质比照品外标法, 其他杂质接纳的是不加校正因子的主身分自身比照法;
《英国药典》31 版中已知杂质依那普利拉接纳的是加转换因子的杂质比照品外标法, 依那普利双酮接纳的是加转换因子和校正因子的主身分比照品外标法, 其他杂质接纳的是不加校正因子的主身分比照品外标法。
由于差别盘算要领所体现的意义差别, 所以得出的结果也不相同。表2 就是某企业生产的马来酸依那普利片, 按上述差别盘算要领得出的杂质的含量结果。
由表2可知, 差别的盘算要领得出有关物质中已知杂质和总杂质的含量不尽相同, 如果接纳统一的限度, 就会泛起同一杂质接纳差别的盘算要领, 结果在有些情况下切合划定, 而有些情况下不切合划定的现象, 这种情况下只能凭据差别的盘算要领和有关要求制订合理的限度。
随着液相色谱技术的进一步完善, 新型检测器的不绝开发, 以及种种类型检测器的联合应用, HPLC将在有关物质检查中发挥更大的作用。
文章来源：《中国药品标准》
作者：余振喜, 庾莉菊, 黄海伟, 张启明
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